Влияние w-3 ненасыщенных кислот на функциональные свойства тромбоцитов и нейтрофилов, содержание оксида азота и тонус сосудов у больных диабетической нефропатией и артариальной гипертензией

И.И.Топчий
Институт терапии АМН Украины, г. Харьков, Украина

Несмотря на научно-технический прогресс в области фундаментальных исследований биологии клетки, улучшение качества медицинского обслуживания больных с прогрессирующими заболеваниями почек, в последние годы прошедшего века отмечена все возрастающая распространенность хронической почечной недостаточности как в развивающихся странах, так и в высокоразвитых с экономической точки зрения государствах. В 2000 году распространенность терминальной почечной недостаточности составляла около 1 тысячи на миллион населения, в США количество таких пациентов к настоящему времени достигает 350 тысяч, т.е. 1100 пациентов на один миллион жителей, что связано как с увеличением количества пациентов с прогрессирующими нефропатиями при таких распространненых заболеваниях как гипертоническая болезнь, сахарный диабет и подагра, так и с увеличением продолжительности жизни этих пациентов в странах с высоким уровнем медицинского обеспечения. Заболеваемость и смертность у больных с прогрессирующей почечной недостаточностью остаются очень высокой, сравнимой только с онкологическоми заболеваниями. Показатель смертности среди пациентов с заболеваниями почек в пять раз выше, чем таковой в общей популяции, при этом ведущей причиной заболеваемости и смертности среди таких пациентов являются сердечнососудистые заболевания, составляющих приблизительно 50% летальных случаев. Среди пациентов находящихся на лечении программным гемодиализом, смерть от кардиоваскулярных причин происходят приблизительно в 20-30 раз чаще чем в общей популяции. Выяснение причин и особенностей развития сердечно-сосудистых заболеваний у лиц с заболеваниями почек является в настоящее время одной из актуальнейших проблем нефрологии. Одним из наиболее ярких открытий последних лет, имеющих важное значение в клинической медицине и позволяющих по-новому подойти к пониманию механизмов развития ряда физиологических и патологических процессов в организме, является установление роли оксида азота (N0) в жизненно важных процессах - он является нейротрансмиттером, цитотоксическин агентом, влияет на агрегацию тромбоцитов и рассматривается в настоящее время как один из основных факторов регуляции сосудистого тонуса. Окись азота образуется из аминокислоты L-аргинин, поступающего в клетку с помощью специфического транспортирующего фактора. Под влиянием ферментов, катализирующих синтез окиси азота, N0-синтетаз, происходит инкорпорирование молекулярного кислорода к атому азота из терминальной гуанидиновой группы L-аргинина. При этом помимо окиси азота, образуется одновременно неактивное соединение L-цитрулин, которое затем вновь рециклируется, пополняя внутриклеточные запасы аргинина. Помимо этого N0 оказывает влияние и на другие клеточные компоненты: а) взаимодействует с тиоловыми группами на белках и маленьких молекулах, формируя S-нитрозотиолы; б) оксид азота может влиять на Fe\S группы в каталитических центрах белков, включая гемоглобин. Необходимо отметить чрезвычайно важную способность оксида азота формировать пероксинитриты при взаимодействии с супероксидными радикалами, что приводит к токсичности клеток через склонность пероксинитритов стимулировать пострансляционные изменения в тирозиновых остатках белков. Таким образом, биологические эффекты оксида азота зависят как от концентрации произведенного N0, так и от особенностей локальной окружающей среды, особенно от наличия и выработка тиолов и пероксинитритов. Нарушение метаболизма оксида азота приводит к ремоделированию сосудистой стенки - изменению структуры и функциональной активность ее клеток [6]. Такое ремоделирование сосудов у больных прогрессирующими заболеваниями почек является одной из форм структурного ответа сосудов на метаболические и гемодинамические изменения, обусловленные течением основного заболевания, увеличеннием напряжение сдвига вследствие повышения вязкости крови. Гипертрофия сосуда усиливает вазоконстрикторный отет на нейрогуморальные факторы, способствуя поддержанию повышенного артериального давления; повышение жесткости сосудистой стенки вследствие увеличения содержания натрия и воды - нарушению в азодилятирующего ответа при почечной недостаточности. К факторам способствующим нарушениям структуры и функции сосудистой системы, наряду с гипертензией, относятся также нарушения липидного баланса, изменения агрегатного состояния крови, воспалительные поражения сосудов, оксидантный стресс и др. Эти реакции лежат в основе процессов окисления липидов мембран сосудистой стенки; кроме этого и ангиотензин II способен вызывать дисфункцию эндотелия путем накопления в эндотелии эндоперекисей, способствуя формированию аномального ответа сосудов на действующие физиологические стимулы.

Многочисленные исследования по коррекции факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний показали эффективность применения омега-3 ненасыщенных жирных кислот. Однако влияние этих препаратов на патофизиологию сосудистых нарушений изучено недостаточно, требуют уточнения механизмы действия оксида азота и нитрозотиолов на систему гемостаза у больных с заболеваниями почек. В связи с этим в последние годы поднимается вопрос о применении в нефрологии препаратов, которые наряду с влиянием налипидный обмен способны модулировать синтез оксида азота.

Целью нашей работы явилось изучение влияния w-3 ненасыщенных жирных кислот на функциональные свойства форменных элементов крови - тромбоцитов и нейтрофилов, содержание оксида азота и тонус сосудов больных ДН с артериальной гипертензией.

Материалы и методы исследования
Обследовано 28 больных компенсированым сахарным диабетом и диабетический нефропатией (ДН) с артериальной гипертензией, все мужчины, средний возраст - (43,8 лет), контрольную группу составили 10 практически здоровых лиц соответствующего пола и возраста. В базальных условиях частота сердечных сокращений у больных составляла 72+7 ударов в мин. Артериальное давление (АД) систолическое (САД) составило 188+28 мл.рт.ст. и диастолическое (ДАД) - 108+12 мм.рт.ст. У всех больных ДН выявлен мочевой синдром (протеинурия, цилиндрурия, микрогематурия), - уровень креатинина не превышал 0,160 ммоль/л, уровень гемоглобина -100±5 г/л.

Диагноз ДН устанавливали с учетом жалоб больных, анамнеза заболевания, данных объективного обследования, лабораторных и инструментальных методов исследования. Клиническая стадия ДН устанавливалась в соответствии с классификацией C.E. Mogensen (1983).

Все пациенты получали базовую гипотензивную терапию с применением ингибитора АПФ (эналаприл) и недигидропиридинового антагониста кальция - (дилтиазем). 18 больных (основная группа) на фоне базовых гипотензивных средств принимали w-3 жирные кислоты (540 мг эйкозопентаеновой кислоты (ЭПК), 360 мг докозагексаеновой (ДГК) и 2 мг альфа-токоферола (препарат "Новая жизнь 1000", New Spirit Naturals, USA) 3 раза в день в течение 2 месяцев.

Периферическая гемодинамика изучалась на компьютерном комплексе психофизиологического тестирования "Гамма" (оригинальный прибор, патент Украины №28748A). Определялись следующие параметры:

• спектр сердечного ритма с его вариабельностью (коэффициент вариабельности от 0 до 1);
• периферическое сосудистое сопротивление (ПСС); (дин с-1см-5);
• кожное сопротивление (КСС), (ом);
• параметры вегетативного тонуса сосудов (ВТС) - симпатикотония и ва-готония (рассчитывается как производное значений вариабельности сердечного ритма, сосудистого сопротивления). При значениях ВТС больше 1 - симпатикотония, меньше 1 - ваготония;
• ударный объем сердца (УО), (мл); -ударный индекс (УИ) (мл/м²);
• минутный объем крови (МОК), (л);
• степень преобладания артериального притока над венозным оттоком (относительно единицы от 0 до 1);
• степень концентрации внимания по видеотесту (относительно единицы от 0 до 1);
• реакция на световой раздражитель по видеотесту (от 0 до 0,05);

Последние 2 показателя характеризуют проявления энцефалопатии у больного.

Внутрисердечная гемодинамика исследовалась методом эхосонографии на аппарате Aloka SSD-280 LS по стандартной методике, показатели ремоделирования определяли по Ganan N (1992).

Активность системы антиоксидантной защиты (АОЗ) исследовали по таким показателям: активность СОД. содержание глутатионпероксидазы (ГП), каталазы (Кат), SH-групп. Об активности ПОЛ судили по концентрации малонового диальдегида (МДА), содержанию общих липидов.

Уровень стабильного метаболита оксида азота нитрозотиола в плазме крови определяли по методу Griess в модификации Saville с применением высокоэфективной жидкостной хроматографии.

Функциональные свойства тромбоцитов изучали на модели клеточной системы - обогащенная тромбоцитами плазма здоровых доноров и больных ДН и ГБ - которую получали методом дифференциального центрифугирования цитратной крови при 200 об. на протяжении 7 мин. Концентрация тромбоцитов составила 2-3x108 клеток/мл плазмы. Суспензию тромбоцитов инкубировали с L-аргинином на протяжении 15 мин при 37°С. В эксперименте использовали 300 мкМ L-аргинина. АДФ-индуцируемую агрегацию тромбоцитов определяли турбодиметрическим методом. Контролем служила плазма, инкубированная в тех же условиях, но без L-аргинина с добавлением эквивалентного количества TRIS-буфера. Параметром агрегации был выбран индекс агрегации клеток (ИАТ), определяемый по формуле

АТ=(D1-D2)/ D1*100%,

где Dl - оптическая плотность обогащенной тромбоцитами плазмы до добавления индуктора агрегации, D2-оптическая плотность обогащенной тромбоцитами плазмы после добавления индуктора агрегации.

Для сравнения влияния L-аргинина на агрегацию тромбоцитов использовали такой показатель как дельта (D) - повышение индекса агрегации клеток при их инкубации с исследуемыми соединениями по отношению к контрольной пробе, выражаемое в процентах

D = (DTk-AT)/ DTk*100%

где DTk - значение индекса агрегации в контрольной пробе, AT -значение показателя агрегации в контрольной пробе с добавлением L-аргинина.

Агрегационные свойства нейтрофилов измеряли турбодиметрически, с использованием модифицированного метода Yuli в среде Хенкса с Са₂+ и Mg₂+ при температуре 37°С на протяжении 15 минут, используя как индуктор формил-метил-лейцин-фенилаланин в концентрации 106 кл/моль. Концентрация клеток в измеряемом образце составила 3*106 кл/моль, как контроль использовали суспензию клеток в концентрации 10-6 кл/моль. Уровень агрегации виражали как процент агрегировавших клеток.

Для измерения уровня IL-1 применяли твердофазный иммуноферментный метод с использованием пероксидазы хрена. Уровень содержания IL-8 проводили с помощью набора фирмы "Амершам".

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной и непараметрической статистики медикобиологического профиля с помощью пакета прикладних статистических программ, созданных на основе системы управления базой данных "FoxPro" на IBM PS/AT.

Контрольные исследования проводились до лечения и после лечения.

Результаты и обсуждение
В результате проведенного лечения улучшение клинического состояния отметили практически все больные как основной группы , так и группы сравнения - уменьшилось количество приступов стенокардии у больных с ИБС; увеличилось растояние, проходимое без боли у пациентов с атеросклеротическими поражениями сосудов нижних конечностей.

Гемодинамические показатели
Среди обследованных больных коэфициент вариабельности сердечного ритма составил 0,3±0,008. Симпатикотония (ВТС 1,45±0,3) была выявлена у 12 человек, ваготония у 11 пациентов (ВТС 0,62±0,03), у остальных больных был смешанный вариант сосудистого тонуса (ВТС 1,1±0,35).

ПСС был относительно выше у симпатотоников (1817±145 дин с-1см-5), чем у ваготоников (1634±98), при сопоставимых значениях УО и УИ (78,5 мл и 43,7 мл/м² соответственно), МОК был на уровне среднестатистических значений для данной категории больных (4,5 л/мин). У симпатотоников относительно ниже степень преобладания артериального притока над венозным оттоком (0,3 и 0,5 соответственно).

В динамике лечения в группе больных, не получавших омега-3 кислоты на фоне снижения артериального давления до оптимальных значений увеличивалась вариабельность сердечного ритма (0,5±0,002) при недостоверном росте ЧСС: что вело к увеличению числа пациентов с симпатикотонией (ВТС вырос по группе до 1,3±0,2). ПСС снижался на 20% от исходного у симпатотоников и на 17% у ваготоников (по группе разница недостоверна) при некотором росте УО и УИ на фоне оптимального увеличения МОК до 5,2 л/мин. Степень артериального кровенаполнения и венозного оттока изменений не претерпевала. Не изменялись и показатели функциональной активности ЦНС по данным видеотестов. В основной группе больных при снижении АД до оптимальных значений (средний уровень 145/95 мм рт.ст.) отмечено, что спектр сердечного ритма, его вариабельность и параметры вегетативного тонуса достоверно не изменялись, существенно снизилось ПСС - на 30% от исходного, относительно больше у симпатотоников, при одновременном росте УО и УИ до 95 мл и 52 мл/мг соответственно, обеспечивая тем самым улучшение общей гемоциркуляции (МОК вырос до 5,5 л/мин), в этой группе больных достоверно (р<0,5) увеличился коэфициент прироста артериального притока (до 0,7±0,008 ед.). При этом отмечено существенное улучшение (р<0,5) параметров функционирования ЦНС - степень концентрации внимания выросла до 0,7, а время реакции на раздражитель составило 0,14 сек, что свидетельствует о значимом церебропротективном действии препарата New Life.

Показатели перекисного окисления липидов. Из приведеных данных видно, что в начале исследования показатели ПОЛ у больных были повышены (р<0,05), а антиоксидантная система угнетена, (табл. 1). После лечения уровень МДА в сыворотке крови уменьшился наблюдалась также тенденция к повышению концентрации СОД, общих тиоловых групп, каталазы и ГП (табл. 2).

Изменения содержания стабильного метаболита оксида азота. Нитрозотиол играет важную роль в превращениях и функционировании оксида азота в живых системах: во первых он может выступать в качестве депо и транспортного средства оксида азота и во вторых, может обеспечивать превращение нейтральных молекул оксида азота при физиологических значениях рН в ионы нитрозония, стабилизировать и переносить последние в клетках и тканях. В проведенном нами исследовании было установлено, что содержание нитрозотиола у больных диабетической нефропатией несколько повышено по сравнению с контролем. В динамике лечения оно снижается как в основной группе, так и в группе сравнения (табл. 3).

Такие данные могут свидетельствовать о том, что под влиянием ангиотензина II, эндотелина и других вазоктивных субстанцией у больных с арериальной гипертензией увеличивается тонус артериальных сосудов и для компенсации этих изменений в крови повышается содержание стабильного метаболита оксида азота. Под влиянием ингибиторов АПФ, и антагонистов кальция напряженность в систем ренин-ангиотензиновой системы снижается, уменьшается периферическое сосудистое сопротивление, а вместе с его нормализацией снижается и количество депонированного оксида азота. Несколько более значительное снижения нитрозотиола в группе больных получавших препарат "Новая жизнь 1000" может быть связано с гиполипидемическим и антиоксидантным действием препарата, хотя эти показатели не достигают достоверных значений. Кроме того, такой эффект может быть связан с уменьшением актиности iNО-синтазы. Недавние исследования Ling at al. (1998) показали, что проксимальные тубулы, полученные от мышей с целенаправленным удалением iNO-синтазы были стойкими к гипоксии, в то время канальцы полученные от мышей с недостатком еNО-синтазы или nNO-синтазы был повреждены при такой же самой степени гипоксии. Эти исследования поддерживают идею, согласно которой, несмотря на то, что конечный продукт - оксид азота - для всех троих ферментов является общим, осложнения от их активации значительно различаются. Это обусловлено, по всей вероятности, различиями во времени и месте выделения оксида азота под воздействием различных NO-синтаз. Кроме того, ангиотензин II может катализировать пероксинитрит-индуцированную модификацию белков-мишеней. Следовательно, теоретически предпочтительным путем для ограничения окислительного и нитрозативного стресса могла быть высоко селективная ингибиция iNO-синтазы или удаление примесей пероксинитрита. Снижение количества перекисей и нитрозотиола под воздействием препарата "Новая жизнь 1000" в какой-то мере способствует этому процессу.

Функциональная активность тромбоцитов. Полученные данные свидетельствуют о качественном отличии ответа кровяных пластинок на индукцию АДФ у практически здоровых лиц и больных ДН (р<0,05). Так как поражение почек у больных сахарным диабетом сопровождается значительным ослаблением активности антиоксидантних ферментов повышение интенсивности свободно-радикальных процессов, наблюдаемое при этом, может способствовать образованию пероксинитрита (0N00-). Повышение агрегации тромбоцитов больных ДН, вероятно, объясняется этим механизмом.

Инкубация обогащенной тромбоцитами плазмы доноров с 300 мкМ L-аргинина привела к ингибированию АДФ-индуцированной агрегации на 20% (р<0,05). В группе сравнения агрегация снизилась на 11% (р<0,05). В группе больных долучавших препарат ?-кислот, агрегация снизилась на 18% (р<0,05) (табл. 4). Ингибирование агрегационной способности тромбоцитов доноров указывает на то, что тромбоциты не лишены N0-синтазной активности, а влияние L-аргинина на тромбоциты больных по-видимому обусловлено повышением содержания N0 через еN0-синтазу в клетке после приема ?-кислот, так как L-аргинин ингибирует агрегацию тромбоцитов больных основной группы в большей степени, чем в группе сравнения.

Функциональные свойства нейтрофилов и уровень интерлейкинов. Известно, что постоянное повышение воспалительных цитокинов играет патогенентическую роль в развитии васкулопатий - свободные радикалы кислорода (H₂0₂, 0Н-, 0-₂) при прогрессирующих заболеваниях почек продуцируются активированными нейтрофильными гранулоцитами, интерстициальными макрофагами, клетками почечных клубочков и стимулируются адгезивными молекулами (фибронектином и ламинином), которые входят в состав базальных мембран клубочков. К увеличению отложения матрикса при экспериментальном сахарном диабете приводит усиление биосинтеза трансформирующего фактора роста. В 2001 году были опубликованы результаты исследований Paolo Menc и соавт., в которых было показано, что моноцитарные клетки, которые выдерживались в культуре с высоким содержанием глюкозы модифицируют пролиферацию и накопление матрикса, а повышенное содержание глюкозы усиливает проникнование моноцитов в ткани почек при диабете. В нашем исследовании было установлено, что у больных диабетической нефропатией изменяются функциональные свойства и нейтрофилов (табл. 5). Так как в ряде исследований были установлены иммуномодулирующие свойства w-3 жирных кислот мы исследовали влияние препарата "Новая жизнь 1000" на содержание интерлейкинов. Полученные данные свидетельствуют об увеличении содержания IL-1 та IL-8 у больных ДН, по-видимому обусловленное повышением активности как нейтрофилов, так и моноцитов, Под влиянием проведенного лечения их активность снизилась (табл. 6).

Полученные нами данные не соглагуются с результатами Т-Holm et al. (1) в соответствии с которыми назначение высоко сконцентрированных omega-3 жирных кислот больным с пересаженным сердцем может изменять баланс между воспалительными противовоспалительными цитокинаит в воспалительном направлении. Возможно, это обусловлено специфическими изменениями иммуной системы после трансплантации и назначением иммуносупрессоров.

Заключение
Полученные нами данные свидетельствуют о важном патогенетическом значении эндотелиальной дисфункции в развитии сердечно-сосудистых осложенний при сахарном циабете. Длительное сохранение повышенного уровня нитрозотиола у больных ДН может приводить к цитооксическому влиянию на почки, возможно в связи с образованием пероксинитрита. Разобщение деятельности N0-синтетаз и нарушение обмена оксида азота приводит к ухудшению вазорелаксации резистивных артерий, диапедезу полиморфно-ядерных лейкоцитов, усиленному синтезу цитокинов, прокоагулянтному и проагрегантному состоянию. Локальное сужение сосудов прогрессирует в связи с повышением чувствительности к ангиотензину II и другим вазоконстрикторам. Эти сосудистые нарушения сопровождаются изменениями механизмов, которые включают не только индукцию iN0-синтазы и увеличение синтеза реактивных промежуточных звеньев кислорода в почечных эпителиальных клетках, но также и генерирование пероксинитритов путем инфильтрации полиморфоядерных клеток и макрофагов. Так как сосудистые нарушения инициируют каскад реакций, в конечном счете приводящих к разрушению эндотелия клубочков и эпителия канальцев, включение в схемы лечения препаратов, которые приводят к коррекции эндотелиальной дисфункции позволит прервать патофизиологические механизмы развития прогрессирующей нефропатии и ее осложнений.

Таблица 1. Содержание продуктов ПОЛ и компонентов антиоксидантной системы у больных до лечения (р<0,05)

Таблица 2. Содержание продуктов ПОЛ и компонентов антиоксидантной системы в крови больных после лечения

Таблица 3. Содержание нитрозотиола в плазме крови больных (мкмоль/л)

Таблица 4. Индекс агрегации тромбоцитов здоровых доноров и больных ДН

Таблица 5. ФМЛФ - индуцированная агрегация (%) нейтрофилов у больных ДН до и после лечения

Таблица 6. Уровень IL-1 и IL-8 в сыворотке крови больных (пкМоль/л)